O vírus da hepatite C, ou HCV, causa uma infecção crônica do fígado que pode levar a cicatrizes permanentes no fígado e, em casos extremos, câncer. Afeta cerca de 71 milhões de pessoas em todo o mundo e causa aproximadamente 400.000 mortes a cada ano. Embora existam tratamentos disponíveis para infecções relacionadas ao HCV, eles são caros, de difícil acesso e não protegem contra reinfecções. Uma vacina que pode ajudar a prevenir a infecção pelo HCV é uma grande necessidade médica e de saúde pública não atendida.
Uma das principais razões pelas quais ainda não existe uma vacina contra o HCV é que os cientistas ainda não identificaram o antígeno adequado, ou a parte do vírus desencadearia uma resposta imune protetora no corpo.
Décadas de pesquisa identificaram o HCV E1E2, a única proteína na superfície do vírus, como o candidato a vacina mais promissor. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina contra o HCV com base nessa proteína é limitado pela incerteza sobre sua aparência. É necessário conhecer a estrutura da proteína para descobrir como o sistema imunológico responde ao vírus.
Então, como os pesquisadores capturam a estrutura de uma única proteína em um vírus que muda de forma?
Somos pesquisadores especializados em microscopia e design de vacinas. Com a nova tecnologia, conseguimos visualizar os detalhes moleculares dessa proteína indescritível, revelando informações importantes sobre como esse vírus funciona e oferecendo um modelo potencial para uma futura vacina.
Foi assim que fizemos.
Desafios de capturar um vírus que muda de forma
Uma das razões pelas quais tem sido tão difícil capturar a estrutura da proteína HCV E1E2 é que ela é flexível e frágil. Ela muda de forma com tanta frequência e é tão facilmente quebrada que é difícil purificá-la.
Como analogia, imagine uma tigela de espaguete embebida em molho de tomate. Agora imagine tentar tirar uma foto de cada pedaço individual de espaguete na mesma posição ao longo do tempo enquanto a tigela está tremendo. Difícil de fazer, certo? Foi assim que imaginou a proteína E1E2 completa.
Havia também barreiras tecnológicas. Até recentemente, as técnicas de imagem disponíveis eram limitadas em sua capacidade de visualizar proteínas microscópicas. A cristalografia de raios-X, por exemplo, é incapaz de capturar moléculas que frequentemente mudam de forma, como o HCV. Além disso, outras opções, como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear, exigiam cortar grandes partes da proteína ou manipulá-la quimicamente de forma a transformar seu estado fisiológico e potencialmente alterar sua função.
Então, para examinar a estrutura de E1E2, precisávamos de uma maneira de extrair e purificar, estabilizar e prender toda a proteína que muda de forma em uma configuração.
Como tirar uma foto de proteína
Cryo-EM, ou microscopia crioeletrônica, é um tipo de técnica de imagem que visualiza espécimes em temperaturas criogênicas, neste caso, o ponto de ebulição do nitrogênio: menos de 196 graus Celsius. Com temperaturas tão baixas, o gelo congela tão rapidamente que não dá tempo de cristalizar. Isso cria uma bela moldura de vidro ao redor da proteína de interesse, permitindo uma visão desimpedida de cada detalhe estrutural. O Cryo-EM também requer pouca proteína para funcionar, reduzindo a quantidade de material que precisaríamos purificar.
Vencedor do Prêmio Nobel de Química de 2017 e do prêmio “Método do Ano” de 2015 da revista Nature, o cryo-EM é excelente para imagens de macromoléculas biológicas em seu estado nativo ou natural no ambiente aquoso do sangue humano. O Cryo-EM também foi fundamental para caracterizar a estrutura do vírus COVID-19 e suas variantes.
Então, como você tira uma foto de uma proteína?
Primeiro, incorporamos o código genético para produzir E1E2 em células humanas em uma placa de Petri para que tivéssemos quantidades suficientes de proteína para estudar. Depois de purificar a proteína, nós a mergulhamos em etano líquido seguido de nitrogênio líquido. O etano líquido é usado para congelar a proteína porque tem um ponto de ebulição mais alto que o nitrogênio líquido. Isso significa que é capaz de capturar mais calor antes de se transformar em gás, permitindo que a proteína congele muito mais rapidamente do que no nitrogênio líquido e evite danos estruturais.
Depois que a proteína foi vitrificada, ou em um estado de gelo semelhante ao vidro, pudemos não apenas ver sua estrutura geral, mas também capturar várias configurações individuais da proteína que ela assume quando muda de forma, incluindo suas formas menos estáveis.
Nesse ponto, nossa proteína estava pronta para uma visão mais detalhada. Empregamos um microscópio que usa um feixe de elétrons focados de alta energia e uma câmera muito sofisticada que detecta como as escolhas rebatem na superfície da proteína. Isso criou uma imagem 2D que transformamos matematicamente em um modelo 3D. E foi assim que obtivemos o cobiçado “close-up” da proteína de superfície do HCV.
Nosso próximo passo foi avaliar a localização de cada aminoácido, ou bloco de construção da proteína, no espaço 3D. Como cada aminoácido tem uma forma única, usamos um programa de computador que pode identificar cada um em nosso mapa 3D. Isso nos permitiu reconstruir manualmente um modelo de alta resolução da proteína, um bloco de construção por vez.
Uma nova ferramenta para projetar uma vacina contra o HCV
Nosso mapa 3D e modelo da proteína HCV E1E2 apoiam pesquisas anteriores que descrevem sua estrutura, ao mesmo tempo em que fornecem novas reflexões sobre recursos que ajudarão a abrir caminho para um projeto de vacina há muito procurado contra esse vírus.
Por exemplo, nossa estrutura revela que a interface entre as duas partes principais da proteína é estabilizada por açúcares e manchas hidrofóbicas, ou áreas que empurram para fora as moléculas de água. Isso cria centros de ligação pegajosos ao longo da proteína e evita que ela se desfaça – um local potencial para anticorpos protetores e novos medicamentos atingirem.
Os pesquisadores agora têm as ferramentas para projetar medicamentos antivirais e vacinas contra a infecção pelo HCV.
Fonte: The Conversation / Lisa Eshun-Wilson e Alba Torrents de la Peña
Tradução: Redação Ambientebrasil / Maria Beatriz Ayello Leite
Para ler a reportagem original em inglês acesse: https://theconversation.com/scientists-uncovered-the-structure-of-the-key-protein-for-a-future-hepatitis-c-vaccine-heres-how-they-did-it-193705
